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結直腸癌是一種常見的腫瘤，其發病率在所有惡性腫瘤中排第三。盡 管在西方國家結直腸癌的發病率已經開始下降，但在中國其發病率仍然呈上升趨勢；盡管有關結直腸癌的治療取得很大進展，但仍有50％的患者在治療后出現復 發，這些研究結果都表明改進結直腸癌的治療仍有其必要性[1]。

細胞耐藥性是一直是提高化學治療療效的瓶頸。越來越多的證據表明上皮來源的腫瘤包括結直腸癌是由小部分有自我更新能力的細胞稱為腫瘤干性細胞 （CSC）或者腫瘤起源細胞始動的，CSC有自我更新、分化成腫瘤內各種細胞的能力，及驅動惡性細胞增殖、浸潤、轉移的能力，CSC對化療不敏感是導致腫 瘤的復發的原因之一[2]。目前，識別腫瘤干性細胞的方法是使用特異性的標記物，如結腸癌干性細胞的標記物有CD133、CD44、CD166、ESA等 [3,4]。

Wnt信號通路調節細胞的自我更新和多個器官的形成，其調節失控可導致腫瘤形成。經典的Wnt通路由β-catenin介導，Wnt配體通過 Lrp5/6與axin的直接作用抑制β-catenin降解復合物的激酶活性，導致β-catenin在胞漿內蓄積并轉移到核內，與轉錄因子LEF /TCF家族相互作用，調節Wnt靶基因的轉錄以及促進細胞增殖[5]。超過80％的散發性結腸癌有穩定ß-catenin的突變，并且有持續的經典 Wnt信號通路激活，Wnt信號通路的異常激活在結直腸癌的發生發展過程中起著重要作用[6]。Zhu等[7]發現內源性Wnt信號激活能破壞隱窩的結構 并導致CD133分子在隱窩細胞表達增加，形成高級別上皮內瘤變以及隱窩腺瘤。這一結果提示CD133陽性結腸癌干性細胞與Wnt信號通路之間的潛在聯 系。

我們已發現，氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU）上調干性細胞標記物CD133在結腸癌DLD1細胞中的表達，5-FU可用于體外 富集CD133高表達細胞，CD133高表達細胞的干細胞功能強，包括克隆形成能力、致腫瘤形成能力等[8，9]。CD133陽性的干性細胞對5-FU耐 藥，那么5-FU對CD133陽性結腸癌干性細胞的Wnt信號通路是否有影響、Wnt信號通路活性與干性細胞產生耐藥性有關，干預Wnt信號通路能否對干 細胞耐藥有逆轉作用非常值得探討.

1 材料及方法

1.1 試劑及其來源

5-FU購于Sigma公司，將其溶于雙蒸水中制成100g/ml濃度的儲存溶液，置于-20oC 的冰箱中備用，使用時根據需要稀釋成不同濃度的實驗溶液。Wnt信號抑制劑DKK-1購于PeproTech公司，磷酸緩沖液（PBS）購于 Invitrogen公司。青霉素、鏈霉素和胎牛血清購于GIBCO公司， 培養基DMEM購于Invitrogen公司。CD133的抗體、磁珠微粒及異構體對照購于Miltenyi公司，放線菌素D(7-AAD)(BD Biosciences)，臺盼藍購于（Sigma Aldrich）。磁珠分離機MiniMACSTM購于Miltenyi公司

流式細胞儀使用的型號為FACS Canto II,BD Biosciences，

1.2 細胞培養

結腸癌細胞株DLD1（含Wnt信號通路報告系統的DLD1細胞株，由華盛頓大學干細胞中心Moon教授的實驗室贈送）培養于含100u/ml青霉 素、100µg/ml鏈霉素和10% 胎牛血清(GIBCO）的DMEM，置于5% CO2的培養箱中在370c下培養。用于實驗的細胞最多傳代10次。

1.3 流式細胞儀分析（Fluorescence Activated Cell Analysis, FACS）

單個細胞混懸液與anti-CD133/2 (293C3-PE)10:1 或者異構體對照 (mouse IgG2b -PE)10:1混合40C下染色30分鐘，PBS洗脫后加入7-AAD以排除死細胞對結果的影響，上流式細胞儀檢測CD133陽性細胞的比例，所有試驗 設平行三組，獨立重復三次。

1.4 磁珠細胞分離（Magnetic Activated Cell Separation, MACS）

單個混懸的細胞與anti-CD133/1磁珠微粒40C下混合(AC133, mouse IgG1, cell isolation kit)30分鐘，洗脫后通過磁柱，陽性細胞被吸附，而陰性細胞直接流過柱子，然后將陽性的細胞洗出。磁性分離后，臺盼蘭染色評估細胞活性，分離后的細胞 以流式細胞儀檢測陽性細胞和陰性細胞的純度。細胞與anti-CD133/2 (293C3-PE) 或者異構體對照 (mouse IgG2b -PE)混合染色30分鐘，洗脫后加入7-AAD以排除死細胞對結果的影響，上流式細胞儀檢測CD133陽性細胞的比例。所有試驗設三組并獨立重復三次。

1.5 細胞生長曲線

5.8×105個DLD1、DLD1CD133+和DLD1CD133-細胞分別接種于含1μg/ml 5-FU培養液的6個培養盤中，分別于24小時和48小時后收集細胞，臺盼藍色，以細胞計數器計算每個培養盤中的細胞計數，并計算出均數和標準差，制成生長曲線圖。

1.6 Wnt通路活性熒光酶檢測：

含TCF報告系統的細胞在96孔板中培養，向每個孔內加入至少能夠覆蓋全部細胞的1×PLB（BD Bioscience）。室溫下溫柔振蕩20 分鐘，使細胞充分裂解。將細胞裂解液從板上刮下并儲存于Ep 管中。將Luciferase 和溶劑在用前等體積混合均勻，加入含有細胞裂解液的96孔板孔中。先后在熒光測量儀上測量Firefly、Renilla熒光酶的活性，以 Firefly/Renilla的比值百分數來表示Wnt信號通路的活性。

1.7 DKK-1抑制實驗：

50ng/ml濃度的DKK-1抑制CD133+細胞的Wnt信號通路，48小時后，收集細胞，流式細胞儀檢測CD133的表達。48小時后，洗去 DKK-1，在培養基中加入5-FU 1ug/ml，對照空白組細胞也加入5-FU 1ug/ml，48小時后7-AAD染色凋亡的細胞，流式細胞儀檢測凋亡細胞的比例。

1.8 統計分析

應用SPSS13.0統計軟件分析實驗數據，觀察5-FU處理后細胞Wnt通路活性的改變情況，數據均采用平均值±標準差( ±SD)表示，t檢驗比較兩組間的差別，當P值小于0.05被認為是有統計學差異。

2 結果

2.1 CD133在DLD1細胞株中的表達情況和MACS分離

FACS的方法檢測CD133在結腸癌細胞株DLD1中的表達率為31.2±2.51%，因此以CD133為標記物能顯著區分兩群細胞。通過 MACS方法分離DLD1中的CD133陽性和CD133陰性細胞，分離后的陽性細胞和陰性細胞以CD133+細胞、CD133-細胞表示。再以FACS 方法檢測兩群細胞的純度，CD133+細胞純度為87.2±5.33%，CD133-細胞純度為84.3±4.65%，如圖1所示。

2.2 細胞在含5-FU培養基中生長的比較

5.8×105個DLD1、CD133+和CD133-細胞在含5-FU 1μg/ml的培養液中的生長曲線如圖2所示。CD133+細胞的生長曲線在DLD1細胞（P=0.031）和CD133-細胞（P=0.011）的上 方，CD133+細胞在5-FU的培養基中生長速度明顯較DLD1細胞和CD133-細胞快，而這三群細胞在普通培養基中的生長速度并無明顯差別，說明 CD133+細胞對5-FU的敏感性低于CD133-細胞，P=0.012。

2.3細胞Wnt信號通路活性的差異

含TCF報告系統的熒光酶檢測結果顯示，未分離的DLD1細胞的Wnt信號通路活性為41.2±1.4%，CD133+細胞和CD133-細胞的 Wnt通路活性分別為46.29±0.30%，33.87±2.65%，CD133+細胞的Wnt信號通路活性高于CD133-細胞，P=0.009， 說明CD133+細胞有更強的自我更新能力。

2.4 5-FU對DLD1CD133+、DLD1CD133-細胞的Wnt信號通路活性的影響

0μg/ml（對照組）、1μg/ml及10μg/ml濃度的5-FU處理CD133+、CD133-細胞，檢測處理后的細胞Wnt信號活性強度并 計算出平均值和標準差。結果如圖3所示,小劑量的5-FU(1μg/ml)和大劑量5-FU(10μg/ml)均使DLD1CD133+細胞Wnt信號通 路的活性上調,分別從46.29±0.3%上升到90.06±10.01%(P=0.012)、52.92±2.46%(P=0.047)。CD133- 細胞的Wnt通路活性為33.87±2.65%, 5-FU 1μg/ml、 10μg/ml處理后，Wnt信號通路活性分別為35.51±3.28%和26.45±0.38%，P值分別為0.434、0.046。

2.5 以DKK-1抑制CD133陽性細胞中的Wnt通路活性對細胞的影響

50ng/ml濃度的DKK-1(PeproTech Inc)抑制CD133+細胞的Wnt信號通路，48小時后，CD133的表達從87.21±5.33%降至60.62±3.12%，P=0.022，圖 4A。DKK-1處理后的CD133+細胞的凋亡較比對照組明顯增加，28.3±0.6%比11.8±0.2%，P=0.013，如圖4B所示。

3 討論[Gan5]

腫瘤細胞原發性或者繼發性耐藥是癌癥化學治療的最大瓶頸。治療過程中無法清除對治療不敏感的腫瘤干性細胞是腫瘤復發轉移的根本原因。已有不少研究發現 CSC或者表達干細胞標記物的細胞對常規的腫瘤治療耐藥。Bao等[10]發現手術切除的腦膠質瘤細胞分離出的CD133+CSC由于DNA修復的活性而 耐受離子型放射治療。Todaro等[9]發現CD133+細胞和無血清培養的小球狀細胞對結直腸癌常規化療藥奧沙利鉑和5氟尿嘧啶的敏感性較 CD133-的細胞低，抗IL-4受體的抗體治療降低CD133+細胞的活性，并提高化療的療效，抗IL-4抗體通過降低生存分子而導致小球狀細胞凋亡， 體內抑制IL-4或者中和IL-4的抗體均能縮小異位皮下種植的腫瘤，從而確認了腫瘤干性細胞的模型及CSC對腫瘤治療的耐受性，并提供了耐藥性發生的機 制。Woodward等[11]發現表達干性細胞標記物的乳腺癌干性細胞對放療耐受，并發現異位表達Wnt及β-catenin可擴大耐放射的細胞群，提 示Wnt信號與CSC的自我更新能力和耐受治療的特性相關。有研究通過比較阿霉素敏感和不敏感細胞株之間的基因差別，結果顯示除了MDR1基因表達在耐藥 株中增高外，表達最高是Wnt通路的必需因子--Wnt鬃毛受體-1(FZD1) ，FZD1的上調介導Wnt通路的持續激活和靶基因的激活，ShRNA介導FZD1沉默導致MDR1表達的下調，且使細胞重新獲得對藥物的敏感性 [12]。還有研究報道，肝癌細胞對5-FU的耐藥性與Wnt通路相關，Wnt靶基因只在對藥物不敏感的肝癌細胞中表達，Wnt基因的激活誘導肝癌細胞對 5-FU的耐藥性[13]。

然而，化療藥物對腫瘤干性細胞中的Wnt信號通路的影響，以及Wnt信號通路活性對CSC耐藥性的影響還未見報道。我們之前已經建立以CD133陽性細胞 為結腸癌干性細胞的研究系統，并發現常規的化療藥物5-FU能增加干性標記物CD133在結腸癌細胞中的表達，且增加細胞的干性[8]。本研究以 CD133為標記物分離DLD1細胞株中的干性細胞，比較CD133陽性干性細胞和CD133陰性分化細胞之間Wnt信號通路活性的差別，發現CD133 陽性干性細胞的Wnt信號通路的活性強于CD133陰性細胞，與干性細胞自我更新能力強相一致；5-FU使CD133陽性細胞Wnt信號通路變得更強，說 明5-FU不僅不能抑制CD133+細胞的Wnt信號通路活性，反而增強了CD133+細胞的Wnt信號通路活性，增加CD133+細胞的自我更新能力， 可能與形成正反射相關，使化療藥物更加難以進入干性細胞內，且5Fu對CD133陽性干性細胞的反復刺激可能誘發Wnt信號通路系統活性反射性增加，從而 進一步鞏固對藥物的抗性，并逐漸發展對多種藥物的耐受性，小劑量5-FU對CD133陰性細胞的Wnt通路活性沒有影響，大劑量5-FU抑制Wnt信號通 路活性，抑制CD133陰性細胞陰性細胞增殖，對Wnt信號通路活性低下的CD133陰性細胞，5-FU可進入細胞后通過干擾DNA合成致Wnt通路活性 的降低；CD133陽性細胞在含5-FU的培養基中增殖速度明顯比CD133陰性細胞快，CD133陽性細胞對化療藥物5-FU敏感性低；以Wnt信號通 路抑制因子DKK-1處理CD133陽性結腸癌干性細胞后，細胞對5-FU的敏感性增加，說明抑制Wnt信號通路能部分逆轉CD133+細胞對藥物的耐受 性。因此，研究Wnt信號通路在結腸癌腫瘤干細胞耐藥產生中起的作用有廣闊的應用前景，可能通過該領域的研究開發出抗腫瘤干細胞的藥物。

綜上所述，Wnt信號通路參與了CD133+結腸癌干性細胞耐藥性的調節，常規化療藥5-FU使CD133陽性結腸癌干性細胞的Wnt信號通路活性進一步 增強，與腫瘤干細胞對化療不敏感相關，抑制Wnt信號通路的活性可能增加結腸CSC對化療藥物的敏感性。進一步的研究還應該探討Wnt信號通路調節細胞藥 物敏感性的位點、研究全面干預Wnt信號通路的活性對藥物敏感性的影響、體內研究聯合抗Wnt信號通路的藥物和化療藥物對腫瘤的抑制作用。
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